Τα αντιπυρηνικά αντισώματα και τα αναλυτικά σφάλματα κατά τον προσδιορισμό τους με διαφορετικές εργαστηριακές μεθόδους

 

Πέτρος Καρκαλούσος

 

Περίληψη

Μία κατηγορία αυτοάνοσων νοσημάτων χαρακτηρίζεται από την παρουσία στον ορό του ασθενούς αντισωμάτων έναντι αντιγόνων του πυρήνα (λ.χ. συστηματικός ερυθηματώδης λύκος, σύνδρομο Sjφgren, σκληρόδερμα κ.α.). Μία μεγάλη ομάδα αντιπυρηνικών αντιγόνων έχει σήμερα ταυτοποιηθεί (ds-DNA, SSA, SSB, Sm, snRNP, Jo-1, Scl70, ACA, Ιστόνες) και μετράται συχνά σε ανοσολογικά εργαστήρια, είτε με μεθόδους όπου προσδιορίζεται η ολική ποσότητα των αντιπυρηνικών αντισωμάτων (screening), είτε με ποσοτικές ή ποιοτικές μεθόδους μέτρησης κάθε αντισώματος χωριστά. Συνήθως ως μέθοδος διαλογής (screening) χρησιμοποιείται ο έμμεσος ανοσοφθορισμός (IFA) σε κύτταρα Hep-2 οπότε ανάλογα με το είδος και την θέση των αντιγόνων που ανιχνεύονται παρουσιάζεται διαφορετική εικόνα: ως στικτός, ομοιογενής, περιφερικός, κεντρομεριδιακός, πυρηνισκικός και κυτταροπλασματικός φθορισμός. H δυσκολία στην εκτέλεση και η απαιτητική εκπαίδευση των αναλύσεων IFA οδηγούν πολλά εργαστήρια να εκτελούν παράλληλα και ανοσοενζυμικές μεθόδους (ELISA) για την ποιοτική ή ποσοτική εκτίμηση των αντιπυρηνικών αντισωμάτων. Μεταξύ των μεθόδων IFA και ELISA παρατηρούνται πολλές φορές σημαντικές αποκλίσεις. Οι αποκλίσεις αυτές αποδίδονται στη διαφορετική ευαισθησία των δύο μεθόδων, αλλά και σε διαφορετική αξιολόγηση των αποτελεσμάτων οφειλόμενη στον ανθρώπινο παράγοντα.

 

 Λέξεις κλειδιά: Αυτοάνοσα νοσήματα, Εργαστηριακή διάγνωση, Συστηματικός ερυθηματώδης λύκος, αντιπυρηνικά αντισώματα, έμμεσος ανοσοφθορισμός


 

 Correlation of fluorescence’s images of antinuclear antibodies with the results from their quantification with enzymatic immunoassays

 

 Summary

Among the autoimmune diseases a large group of them is related to the presence of serum antibodies against nuclear antigens (i.e. Systemic lupus erythematosus, Sjφgren syndrome, Scleroderma e.t.c.). Α number of such anti-nuclear antibodies has been identified and determined in daily routine (ds-DNA, SSA, SSB, Sm, snRNP, Jo-1, Scl70, ACA, Histones). Usually, they are firstly determined by screening methods, where the total quantity of antinuclear antibodies is measured, and secondly by quantitative or qualitative methods for each antinuclear antibody separately. In most of cases the indirect fluorescence (IFA) on Hep-2 cells is selected as screening method. IFA results in different images depending of the kind and the location of antigens (homogeneous, speckled, nucleolus, centromere, cytoplasmatic, nuclear rim). Because of the difficulties in daily determination and training of the IFA methods, many laboratories determine antinuclear antibodies with immunoenzymatic methods (ELISA) too. In this case the laboratories find many deviations between the two methods. These deviations are due to the different analytical sensitivity and specifically of the various methods and commercial reagents used and also to the influence of human factor.

Key words: Autoimmune diseases, Laboratory diagnosis, Systemic lupus erythematosus, Antinuclear antibodies, Indirect fluorescence immunoassay

 

Τα αυτοάνοσα ρευματικά νοσήματα

 

Με τον όρο αυτοάνοσα χαρακτηρίζονται εκείνα τα νοσήματα που προκαλούνται από την αντίδραση του ανοσολογικού συστήματος κατά ιδίων αντιγόνων υπό τη μορφή είτε αυτοαντισωμάτων είτε αυτοδραστικών κυτταροτοξικών Τ-λεμφοκυττάρων (CD8). Παρά τον ορισμό αυτό όμως δεν νοούνται ως αυτοάνοσα, νοσήματα χωρίς κλινικά συμπτώματα μια που αυτοαντισώματα ή αυτοδραστικά Τ-λεμφοκύττταρα παρατηρούνται και σε υγιή άτομα λ.χ. σε ηλικιωμένους. Αυτοάνοση απόκριση εμφανίζεται επίσης, με αναστρέψιμο όμως χαρακτήρα, σε άτομα που πάσχουν από χρόνιες λοιμώξεις, σε άτομα που έχουν εμβολιασθεί ή τέλος μετά από τη λήψη διαφόρων φαρμάκων λ.χ. ο φαρμακογενής λύκος1-3. Μεταξύ των πολλών αυτοάνοσων νοσημάτων μία μεγάλη ομάδα ταυτίζεται με τον προσδιορισμό στον ορό των ασθενών αντιπυρηνικών αντισωμάτων, τα ANA (AntiNuclear Antibodies). Με τον όρο αντιπυρηνικά αντισώματα χαρακτηρίζονται όλα τα αντισώματα που αντιδρούν με αντιγόνα του πυρήνα των κυττάρων. Μεταξύ αυτών έχουν ταυτοποιηθεί τα αυτοαντισώματα κατά των ελίκων του DNA, καθώς και μία μεγάλη ομάδα αντισωμάτων έναντι «αντιγόνων πυρηνικού εκχυλίσματος». Τα τελευταία ονομάζονται συνολικά ΕΝΑ (Extractable Nuclear Antigens).  

Τα αντιπυρηνικά (ΑΝΑ) αντισώματα και ο προσδιορισμός τους

 

Τα αντιγόνα των ΑΝΑ ανήκουν σε εννέα διαφορετικές κατηγορίες (Πίνακας 1)1-10. Τα περισσότερα εξ αυτών σχετίζονται με το συστηματικό ερυθηματώδη λύκο (ΣΕΛ) και με άλλα αυτοάνοσα νοσήματα (Sjφgren, πολυμυοσίτιδα, σκληρόδερμα κ.α.).

Τα αντισώματα έναντι των ιστονών αφορούν και τις πέντε τάξεις τους (H1, H2A, H2B, H3 και Η4). Απαντώνται άλλοτε κυρίως στο φαρμακευτικό ΣΕΛ και λιγότερο στον ενεργό ΣΕΛ και στη ρευματοειδή αρθρίτιδα1-11 και συνήθως ο προσδιορισμός τους με ELISA αφορά συνολικά και τις πέντε τάξεις ιστονών.

Το αντιγόνο Sm ανακαλύφθηκε το 1966 από τους Tan και Kunkel 1–9, 12-15 και ονομάστηκε έτσι από το όνομα του πρώτου διαγνωσμένου ασθενή (Smith). Πρόκειται επτά πρωτεΐνες (Β/Β’, D1, D2, D3, Ε, F, G) οι οποίες αποτελούν τον πυρήνα των ριβονουκλεοπρωτεϊνών (sn-RNP) U1, U2, U4 και U5. Oι πιο συχνές πρωτεΐνες – στόχοι των αντισωμάτων αντι-Sm είναι οι Β/Β’, D1 και D3. Σε πολλά kit ELISA τα αντισώματα αναζητούνται ως αντι-Sm/RNP λόγω των κοινών επίτοπων των αντι-Sm και αντι-RNP.

Tα αντισώματα έναντι των ριβονουκλεοπρωτεϊνών (snRNP) ανακαλύφθηκαν το 1972 από τους Reichlin και Mattioli 1–9, 13-17. Tα αντι-RNP αντιδρούν έναντι τριών ειδών πρωτεϊνών που φέρουν τα κωδικοποιημένα ονόματα 70 kd, A, C. Οι πρωτεΐνες αυτές είναι ενωμένες με μικρά μόρια ριβονουκλεϊνικού οξέος (RNA) που βρίσκονται στον πυρήνα και περιέχουν σε μεγάλη ποσότητα ουριδυλικό οξύ (εξ ου και ο συμβολισμός τους U1-RNA). Τα συμπλέγματα μορίων RNA και πρωτεϊνών ονομάζονται μικρές πυρηνικές ριβονουκλεοπρωτεΐνες (small nuclear U1 RNP ή snU1-RNP). Τα αντι-RNP αντισώματα αναγνωρίζουν κυρίως αντιγόνα snU-RNP που περιέχουν τα συμπλέγματα U1α και U RNA.

To όνομα του αντιγόνου Jo-1 προέρχεται από το όνομα του πρώτου ασθενή στον οποίο ανιχνεύτηκε (John P), από τους Nishikai και Reichlin 1–9, 18-20. Πρόκειται για το ένζυμο συνθετάση της ιστιδυλ-tRNA και βρίσκεται τόσο στο πυρήνα όσο και στο κυτταρόπλασμα.

Τα αντιγόνα SSA/Ro και SSB/La αρχικά είχαν ονομαστεί Ro και La από τους Clark (1969) και Jones (1968) αντίστοιχα1–9, 21-24. Αργότερα τα δύο αντιγόνα ανακαλύφθηκαν εκ νέου από τους Alspaugh και συν. (1975-76) και πήραν τις ονομασίες SSA και SSB (1979) εξαιτίας του γεγονότος ότι βρέθηκαν σε ασθενείς με σύνδρομο Sjφgren (SS). Κατά τον προσδιορισμό τους πρέπει να λαμβάνεται υπόψη ότι το SSB εντοπίζεται πάντοτε μαζί με το SSA και ότι το SSB έχει κυρίως πυρηνική εντόπιση σε αντίθεση με το SSA που ανιχνεύεται και στο κυτταρόπλασμα.

Το σκληρόδερμα 70 (Scl-70) είναι μία βασική μη-ιστονική πυρηνική πρωτεΐνη που ανιχνεύτηκε αρχικά σε ασθενείς με σκληρόδερμα και το μοριακό της βάρος έχει προσδιοριστεί στα 70 kd. Σήμερα γνωρίζουμε1-9 ότι πρόκειται για το ένζυμο τοποϊσομεράση Ι που έχει στην πραγματικότητα μοριακό βάρος 100 kd και ανιχνεύεται και σε άλλα νοσήματα εκτός του σκληροδέρματος. Ο προσδιορισμός του Scl-70 χρησιμοποιείται για τη διάκριση του διάχυτου σκληροδέρματος από το σκληρόδερμα CREST το οποίο χαρακτηρίζεται από την παρουσία των αντικεντρομεριδιακών αντισωμάτων (ACA).

Τα αντικεντρομεριδιακά αντισώματα (ACA) είναι αντισώματα έναντι των πρωτεϊνών του κινητοχώρου των κυττάρων κατά τη διάρκεια της κυτταρικής διαίρεσης. Τα αντιγόνα με τα οποία συνδέονται είναι τρία πολυπεπτίδια τα CENP-A, CENP-B και CENP-C. Tα αντισώματα έναντι του CENP-B είναι τα συχνότερα απαντώμενα1-9.

Τα αντισώματα έναντι του DNA του πυρήνα (αντι-DNA) ανακαλύφθηκαν το 1957 από πολλές ομάδες Αμερικανών ερευνητών1-9. Διακρίνονται σε αντι-ss DNA (έναντι απλής έλικας DNA) και αντι-ds DNA (έναντι διπλής έλικας DNA). Τα αντι-ds DNA αντισώματα θεωρούνται ότι παίζουν ενεργό ρόλο στην παθογένεια του ΣΕΛ αν και σπανιότερα εμφανίζονται και στη ρευματοειδή αρθρίτιδα. Φαίνεται ότι τα αντι-ds DNA δεσμεύονται από το DNA του πυρήνα με επακόλουθο την εναπόθεση ανοσοσυμπλεγμάτων στους ιστούς (λ.χ. στα αγγειώδη σπειράματα των νεφρών).  Αντίθετα τα αντι-ss DNA δεν θεωρούνται ειδικά για κάποια νόσο αφού αυξάνονται σε πολλές αυτοάνοσες ρευματικές παθήσεις όπως είναι η ρευματοειδής αρθρίτιδα, η πρωτοπαθής χολική κίρρωση, η χρόνια ενεργός ηπατίτιδα κ.α.

 

Αντιγόνα

Συμβολική ονομασία

Πάθηση

Εικόνα Έμμεσου Ανοσοφθορισμού

Ιστόνες

H1, H2A, H2B, H3 Η4

Φαρμακευτικός λύκος (95 - 100%)

ΣΕΛ (30–50%)

Χρόνια πολυαρθρίτιδα (15–20%)

Διάχυτος ομοιογενής φθορισμός πυρήνα

Smith

Sm

ΣΕΛ (20 – 30%)

Φαινόμενο Raynaud

Αδρός ή λεπτός στικτός φθορισμός πυρήνα

Ριβονουκλεοπρωτεΐνη

sn-RNP (RNP70, RNPA, RNPC)

‘Ήπιος ΣΕΛ (40%)

Μικτή νόσος συνδετικού ιστού (100%)

Αδρός ή λεπτός στικτός φθορισμός πυρήνα

Sjφgren Α

SSA/Ro

Σύνδρομο Sjφgren (90%)

Μικτή νόσος συνδετικού ιστού (45%)

ΣΕΛ (50%)

Χρόνια πολυαρθρίτιδα (5%)

Αδρός ή λεπτός στικτός φθορισμός πυρήνα

Sjφgren Β

SSB/La

ΣΕΛ (15%)

Σύνδρομο Sjφgren (85%)

Αδρός ή λεπτός στικτός φθορισμός πυρήνα

Σκληρόδερμα 70

Scl-70

Σκληρόδερμα (70%)

Φαινόμενο Raynaud

Σύνδρομο Sjφgren

Αδρός ή λεπτός στικτός φθορισμός πυρήνα ή πυρηνισκικός φθορισμός

John 1 (συνθετάση ιστιδυλ-tRNA)

Jo-1

Πολυμυοσίτιδα, δερματομυοσίτιδα (25 – 35%)

Λεπτός στικτός φθορισμός κυτταροπλάσματος ή περιφερικός φθορισμός

Αντικεντρομεριδιακά

ACA (CENP-A, CENP-B, CENP-C)

Σκληρόδερμα CREST (60%)

Φαινόμενο Raynaud

Μικτή νόσο κολλαγόνου

Λεπτός στικτός κεντρομεριδιακός φθορισμός πυρήνα

Διπλή έλικα DNA

ds-DNA

 ΣΕΛ

Διάχυτος ομοιογενής φθορισμός πυρήνα

 

Πίνακας 1. Τα αντιγόνα αντιπυρηνικών αντισωμάτων που προσδιορίζονται με μεθόδους ELISA. Συσχέτιση με εικόνες έμμεσου ανοσοφθορισμού (σε κύτταρα Hep-2) και οι συνηθέστερες παθήσεις.

 

Μέθοδοι προσδιορισμού των αντιπυρηνικών αντισωμάτων

 

Όπως αναφέρθηκε ο προσδιορισμός των αντιπυρηνικών αντισωμάτων γίνεται σήμερα είτε με έμμεσο ανοσοφθορισμό (IFA) είτε με ανοσοενζυμική μέθοδο (ELISA). Παλαιότερα γίνονταν και με άλλες μεθόδους όπως διπλή ανοσοδιάχυση, αντίθετη ανοσοηλεκτροφόρηση και ανοσοαποτύπωση 8, 9, 25 - 28.

O IFA αναπτύχθηκε το 1941 από τον Albert Coons. Στην επικρατούσα μέθοδο για τα ΑΝΑ (FANA) χρησιμοποιούνται ως κυτταρικό υπόστρωμα καρκινικά κύτταρα λάρυγγα (κωδική ονομασία Hep-2) και ως φθορίζουσα χρωστική η ισοθειοκυανική φλουορεσκίνη (FITC) η οποία, όταν διεγερθεί από το υπεριώδες φως του μικροσκοπίου φθορισμού δίνει πράσινο χρώμα. Τα καρκινικά κύτταρα λάρυγγα διαθέτουν μεγάλους πυρήνες, πολλούς πυρηνίσκους και καλούς μιτωτικούς δείκτες με αποτέλεσμα να αυξάνεται σημαντικά η ευαισθησία της μεθόδου. Παρόλα αυτά η συσχέτιση των διαφόρων εικόνων ανοσοφθορισμού με τα αντιγόνα του πυρήνα δεν είναι απόλυτη αφού υπάρχουν αρκετές επικαλύψεις (Πίνακας 1).

Στο μικροσκόπιο φθορισμού τα φθορίζοντα ΑΝΑ μπορούν να δώσουν πολλές διαφορετικές εικόνες ανάλογα με το σημείο όπου βρίσκονται. Έτσι στο πυρήνα των κυττάρων Hep-2 μπορεί να παρατηρηθεί λεπτός στικτός φθορισμός, αδρός στικτός φθορισμός, ομοιογενής φθορισμός, περιφερικός φθορισμός, πυρηνισκικός φθορισμός και τέλος κεντρομεριδιακός φθορισμός. Π.χ. στο εργαστήριό μας η μεγάλη πλειοψηφία των τύπων φθορισμού στον πυρήνα των Hep-2 ανήκε στο ομοιογενή και στον λεπτό στικτό φθορισμό του πυρήνα (Εικόνα 1). Σπανιότερα τα αντισώματα των ΑΝΑ μπορούν να δώσουν και φθορισμό στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων Hep-2 (κυτταροπλασματικός φθορισμός).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Εικόνα 1. Κατανομή των τύπων έμμεσου ανοσοφθορισμού στον πυρήνα Hep-2 κυττάρων στα αποτελέσματα του 3ου θεραπευτηρίου του Ι.Κ.Α.-Ε.Τ.Α.Μ.

 

 Συνήθως η FANA αποτελεί τη διαδικασία επιλογής των ορών των ασθενών (screening) για να ακολουθήσει στη συνέχεια η ταυτοποίησή τους με μεθόδους ELISA. Στο εμπόριο κυκλοφορούν ανοσοενζυμικοί μέθοδοι προσδιορισμού ds-DNA και ENA, τόσο ως μέθοδοι screening όσο και ως μέθοδοι ποιοτικού (profile tests) ή ποσοτικού προσδιορισμού των επιμέρους ΕΝΑ. Συνήθως η αναζήτηση των ΕΝΑ γίνεται μόνο σε ασθενείς θετικούς κατά FANA. Ο ποσοτικός προσδιορισμός δεν έχει ιδιαίτερη κλινική σημασία, ούτε ο προσδιορισμός τους κατά την κλινική παρακολούθηση των ασθενών.

Σπάνια επίσης γίνεται και ο ποιοτικός προσδιορισμός της διπλής έλικας DNA με ανοσοφθορισμό. Σε αυτή την περίπτωση χρησιμοποιείται ως υπόστρωμα το αιμοπαράσιτο Crithidia lucidiae. O κινητοπλάστης του Crithidia lucidiae έχει αντιγονική συμπεριφορά παρόμοια με αυτή του ds DNA.

 

Εργαστηριακά λάθη στον προσδιορισμό ΑΝΑ 

 

Δεδομένου ότι τα περισσότερα εργαστήρια χρησιμοποιούν για τον προσδιορισμό των αντιπυρηνικών αντισωμάτων έμμεσο ανοσοφθορισμό σε συνδυασμό με κάποια ανοσοενζυμική μέθοδο θα πρέπει να λαμβάνονται πάντα υπόψη οι τυχόν αποκλίσεις που μπορεί να παρατηρηθούν. Συνήθως από τις πολλές επιλογές ποσοτικού ή ποιοτικού προσδιορισμού των ΑΝΑ επιλέγεται να προσδιοριστούν τα αντι-ds-DNA με ποσοτικό προσδιορισμό και τα SSA, SSB, Sm, snRNP, Jo-1, Scl70, ACA, Histones με ποιοτικό προσδιορισμό. Στη περίπτωση αυτή τα εργαστήρια εκτιμούν συνολικά τα ΑΝΑ με τρεις διαφορετικές αναλύσεις (FENA, ds-DNA, ENA). Οι τρεις αυτές αναλύσεις ενδέχεται να διενεργούνται από διαφορετικά άτομα ακόμα και σε διαφορετικούς χώρους του εργαστηρίου. Αυτό έχει σαν αποτέλεσμα να προκύπτουν και αποτελέσματα ασύμβατα μεταξύ τους, τα οποία μπορούν να αποδοθούν στη διαφορετική αναλυτική ευαισθησία των μεθόδων αλλά και στις διαφορετικές οπτικές εκτιμήσεις των εικόνων του έμμεσου ανοσοφθορισμού.

Τα «ασύμβατα» αποτελέσματα εμφανίζονται ιδιαίτερα σε χαμηλούς τίτλους FENA (1/80) γεγονός που έχει σαν αποτέλεσμα είτε θετικά FENA να μην εμφανίζουν κανένα αντίγονο ΑΝΑ στους ανοσοενζυμικούς προσδιορισμούς είτε οι εικόνες ανοσοφθορισμού θετικών FENA να μην αντιστοιχούν στα αντιγόνα ΑΝΑ που προτείνει η βιβλιογραφία (Πίνακας 1).

Στην εικόνα 2 παρουσιάζεται ένα σχετικό παράδειγμα από τα αποτελέσματα του εργαστηρίου μας (βιοπαθολογικό εργαστήριο Τρίτου Θεραπευτηρίου ΙΚΑ). Στην εικόνα δίνεται η κατανομή των αποτελεσμάτων θετικών ανοσοενζυμικών προσδιορισμών ds-DNA και ENA που εμφάνισαν διάχυτο ομοιογενή φθορισμό FENA. Ενώ σύμφωνα με τον πίνακα 1 ο ομοιογενής φθορισμός πυρήνα ταυτίζεται με τα αντι-ds-DNA (το εργαστήριο μας δεν προσδιορίζει ιστόνες), στη κατανομή της εικόνας 2 ο ομοιογενής φθορισμός συμπίπτει και με άλλα αντιγόνα όπως τα SSA, Sm, RNP70, Scl70. 

Προβλήματα σαν αυτά της εικόνας 2 εμφανίζονται όταν:

1.  Αλλάζουν συχνά οι προμηθευτές των kit των ανοσοενζυμικών προσδιορισμών. Η αλλαγή προμηθεύτριας εταιρείας μπορεί να έχει σαν αποτέλεσμα την αλλαγή των τιμών cutoff και των τιμών αναφοράς των μεθόδων.

2.   Αλλάζουν συχνά οι προμηθευτές των kit του FENA. Μια τέτοια αλλαγή μπορεί να απαιτήσει νέα εκπαίδευση αφού οι εικόνες του φθορισμού μπορεί να μην είναι ακριβώς οι ίδιες με την προηγούμενη μέθοδο.

3.  Αλλάζει συχνά το προσωπικό που εκτελεί τα FENA. Τέτοια συχνή αλλαγή έχει σαν αποτέλεσμα να υπάρχει διαφορετική εκτίμηση των εικόνων ανοσοφθορισμού ιδιαίτερα μεταξύ εικόνων που μοιάζουν πολύ μεταξύ τους π.χ. αδρός στικτός φθορισμός και πυρηνισκικός φθορισμός πυρήνα.

4.  Διαφορετικά άτομα εκτελούν τον ανοσοφθορισμό και τους ανοσοενζυμικούς προσδιορισμούς. Το γεγονός αυτό στερεί από το τελικό αποτέλεσμα την συνδιαστική εκτίμηση των αποτελεσμάτων όλων των μεθόδων. Έτσι αποκαλύπτονται προβλήματα ευαισθησίας και ειδικότητας.  

 

 

Εικόνα 2. Κατανομή αποτελεσμάτων ανοσοενζυμικού προσδιορισμού ΑΝΑ δειγμάτων ασθενών που στο προσδιορισμό FENA εμφάνισαν εικόνα ομοιογενή φθορισμού. Παρατηρήστε ότι εκτός από αντισώματα ds-DNA, που προτείνει η βιβλιογραφία, ομοιογενή φθορισμό πυρήνα εμφάνισαν και δείγματα με άλλα αντιπυρηνικά αντισώματα.

 

Η αντιμετώπιση των εργαστηριακών λαθών στο προσδιορισμό ΑΝΑ 

 

Για να περιοριστούν τα εργαστηριακά λάθη στο προσδιορισμό ΑΝΑ θα πρέπει να αντιμετωπιστούν οι τέσσερις παράγοντες λαθών που αναφέρθησαν προηγουμένως. Δεδομένου ότι η αλλαγή των μεθόδων (Kit) και του προσωπικού που τις εκτελεί είναι συχνά αναπόφευκτη θα πρέπει το εργαστήριο να εκτελέσει τα ακόλουθα:

1. Nα γίνονται πειράματα επικύρωσης σε κάθε αλλαγή μεθόδου. Τα πειράματα αυτά αφορούν την ανάκτηση, την επαναληψιμότητα καθώς και την αβεβαιότητα τύπου Α και θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη από το εργαστήριο κατά την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων πριν αυτά δοθούν στους ασθενείς.

2. Θα πρέπει να γίνεται έλεγχος ποιότητας με κατάλληλα δείγματα ελέγχου σε κάθε νέα ανάλυση, καθώς και βαθμονόμηση σε κάθε ποσοτικό προσδιορισμό ELISA.

3. H ανάλυση διπλών δειγμάτων εξασφαλίζει καλύτερη επαναληψιμότητα στις μεθόδους ELISA και θα πρέπει να εφαρμόζεται πιστά.

4. Πριν από την χρήση κάθε νέου kit θα πρέπει το εργαστήριο να μεριμνά να κρατά επιλεγμένα παλιά δείγματα για να συγκρίνει τα παλιά αποτελέσματα με τα νέα. Η σύγκριση αυτή αφορά τον έμμεσο ανοσοφθορισμό αλλά και τις μεθόδους ELISA.

Οι προσδιορισμοί των ΑΝΑ αν και πρόκειται για ένα μόνο εργαστηριακό αποτέλεσμα προέρχονται από διαφορετικές αναλύσεις που γίνονται με διαφορετικές μεθόδους, πολλές φορές από διαφορετικά άτομα και χωριστούς εργαστηριακούς χώρους. Αυτό έχει σαν αποτέλεσμα τα αναλυτικά σφάλματα να είναι εύκολο να εκδηλωθούν αλλά και να αποκαλυφθούν στους ιατρούς και ασθενείς. Η απάντηση σε αυτό το πρόβλημα είναι η πιστή τήρηση των κανόνων ποιότητας, η συνεργασία του προσωπικού αλλά και η έγκριση των αποτελεσμάτων από ένα μόνο άτομο που θα έχει και τον συνολικό έλεγχο όλων των αναλυτικών μεθόδων.

 Βιβλιογραφία

 

1.       Μουτσόπουλος Χ. Αυτοάνοσα ρευματικά νοσήματα: κλινικό φάσμα, Αυτοάνοσα ρευματικά νοσήματα, Ιατρικές εκδόσεις Λίτσας, Αθήνα 1990, σελ. 11-7.

2.       Παυλάτου M. Aνοσοφθορισμός, Ανοσολογία, Ιατρικές εκδόσεις Λίτσας, Τρίτη έκδοση, Αθήνα 1997, σελ. 399-404.

3.       Καρακάση Α. Ανοσολογική διερεύνηση μη οργανοειδικών αυτοάνοσων νοσημάτων – αυτοαντισώματα (Ι), Ελληνική Εταιρεία Ανοσολογίας, Σεμινάριο ανοσολογίας 16ος κύκλος, Αθήνα 1998, σελ. 248-53.

4.       Bradwell A, Hughes R, Karim A. “Immunofluorescent Antinuclear Antibody Tests” in Manual of Molecular and Clinical Laboratory Immunology, 7th Edition, ISBN-10: 1-55581-364-X, Barbara Detrick, Robert G Hamilton and James D Folds, ASM Press 2006, p995–006.

5.       Rampudda M, Marson P, Pasero G. The main stages in the history of systemic lupus erythematosus. Reumatismo 2009; 61(2):145-52.

6.       Agarwal S, Harper J, Kiely P. Concentration of antibodies to extractable nuclear antigens and disease activity in systemic lupus erythematosus. Lupus 2009;18(5):407-12.

7.       Egner W. The use of laboratory tests in the diagnosis of SLE. J Clin Pathol 2000; 53(6):424–32.

8.       Wenzel J, Gerdsen R, Uerlich M, Bauer R, Bieber T, Boehm I. Antibodies targeting extractable nuclear antigens: historical development and current knowledge. Br J Dermatol 2001;45(6):859-67.

9.       Phan T, Wong R, Adelstein S. Autoantibodies to extractable nuclear antigens: making detection and interpretation more meaningful. Clin Diagn Lab Immunol 2002; 9(1):1–7.

10.    Tan E. Antinuclear antibodies: Diagnostic markers for autoimmune diseases and probes for cell biology. Adv Immunol 1989; 44:93-151.

11.     Stummvoll G, Fritsch R, Meyer B, Hoefler E, Aringer M, Smolen J, Steiner G. Characterization of cellular and humoral autoimmune responses to histone H1 and core histones in human systemic lupus erythematosus. Annals of the Rheumatic Diseases 2009;68:110-16.

12.    Zieve G, Khusial P. The anti-Sm immune response in autoimmunity and cell biology. Autoimmun Rev 2003; 2(5):235–40.

13.    Migliorini P, Baldini C, Rocchi V, Bombardieri S. Anti-Sm and anti-RNP antibodies. Autoimmunity 2005; 38(1):47-54.

14.    Habets W, Berden J, Hoch S, Van Venrooij W. Further characterization and subcellular localization of Sm and U1 ribonucleoprotein antigens. Eur J Immunol 1985; 15(10): 992- 97.

15.    Sαnchez-Guerrero J, Lew R, Fossel A, Schur P. Utility of anti-Sm, anti-RNP, anti-Ro/SS-A, and anti-La/SS-B (extractable nuclear antigens) detected by enzyme-linked immunosorbent assay for the diagnosis of systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 1996; 39(6):1055-61.

16.    Luyckx A, Westhovens R, Oris E, Papish W, Bossuyt X, Clinical relevance of measurement of antibodies to individual snU1-RNP Proteins, Clin Chem 2005;10:1888–90.

17.    Feist Ε, Schneider Μ, Brychcy M, Dφrner T, Burmester Γ, Hiepe F. A unique autoantibody pattern of positive anti-Jo-1, anti-U1RNP, and antiproteasome antibodies in autoimmune myositis as a diagnostic challenge. Annals of the Rheumatic Diseases 2003; 62:370-71.

18.    Nishikai M, Ohya K, Kosaka M, Akiya K, Tojo T. Anti-Jo-1 antibodies in polymyositis or dermatomyositis: evaluation by ELISA using recombinant fusion protein Jo-1 as antigen. Br J Rheumatol 1998; 37(4):357-61.

19.    Vαzquez-Abad D, Rothfield N. Sensitivity and specificity of anti-Jo-1 antibodies in autoimmune diseases with myositis. Arthritis Rheum 1996; 39(2):292-96.

20.    Zampieri S, Ghirardello A, Iaccarino L, Tarricone E, Gambari P, Doria A, Anti-Jo-1 Antibodies. Autoimmunity 2005; 38(1):73–8.

21.    Pollock W, Toh B. Routine immunofluorescence detection of Ro/SS-A autoantibody using HEp-2 cells transfected with human 60 kDa Ro/SS-A. J Clin Pathol 2000; 53(7): 565.

22.    Blomberg S, Ronnblom L, Wallgren A, Nilsson B, Karlsson-Parra A. Anti-SSA/Ro antibody determination by enzyme-linked immunosorbent assay as a supplement to standard immunofluorescence in antinuclear antibody screening. Scand J Immunol 2000; 51(6): 612–17.

23.    Pollock W, Toh B. Routine immunofluorescence detection of Ro/SS-A autoantibody using HEp-2 cells transfected with human 60 kDa Ro/SS-A. Clin Pathol 2000; 53(7): 565.

24.    Meilof J, Smeenk R. Autoantibodies and their target antigens in Sjφgren's syndrome. Neth J Med 1992; 40(3-4):140–47.

25.     Γερμενής Α, Αυτοανοσία, Εκδόσεις Παπαζήση, Αθήνα 2000, σελ. 237-65.

26.    Kωτσόβολου Δ, Ανοσοφθορισμός, Ελληνική Εταιρεία Ανοσολογίας, Σεμινάριο ανοσολογίας 16ος κύκλος, Αθήνα 1998, σελ. 49-53.

27.    Κατσιγιάννη Α, Ανοσοφθορισμός, Ελληνική Εταιρεία Ανοσολογίας, Σεμινάριο ανοσολογίας 18ος κύκλος, Αθήνα 2000, σελ. 99-105.

28.    Τερζόγλου Κ, Έμμεσος ανοσοφθορισμός – γενικές αρχές και εφαρμογές στα αυτοάνοσα νοσήματα, Σεμινάριο Pasteur: Σύγχρονη διαγνωστική μεθοδολογία και αυτοάνοσα νοσήματα, Αθήνα 2001, σελ. 191-201.

 

Tελευταία ενημέρωσηΔευτέρα Μαΐου 10, 2010